呋喃妥因代謝物快速檢測試劑盒說明書

呋喃妥因代謝物快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃妥因代謝物將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物呋喃妥因代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物呋喃妥因代謝物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度：   0.04ppb
u 孵育溫度：       25℃
u 孵育時間：       30min~15min
u 樣本檢測下限
肌肉組織    ·································  0.1ppb
雞蛋    ·······································  0.1ppb
蜂蜜   ·········································  0.1ppb 
u 交叉反應率
呋喃妥因代謝物 ·································  100%
呋喃唑酮代謝物 ·······························  ＜0.1%
呋喃它酮代謝物 ·······························  ＜0.1%
呋喃西林代謝物 ·······························  ＜0.1%
u 樣本回收率
肌肉組織   ·································  95%±25%
雞蛋    ······································  95%±25%
蜂蜜   ·······································  75%±25%
三、試劑盒組成

1	微量測試孔	每條8孔，一板12條
2	標準液×6瓶 （1ml/瓶）	0ppb	0.04ppb
		0.12ppb	0.36ppb
		1.08ppb	3.24ppb
3	酶標記物	7ml	紅色帽
4	抗體工作液	7ml	藍色帽
5	底物A液	7ml	白色帽
6	底物B液	7ml	黑色帽
7	終止液	7ml	黃色帽
8	20X濃縮洗滌液	40ml	白色帽
9	2X濃縮復溶液	50ml	透明帽
10	衍生化試劑	10ml	白色帽

四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20~200μl、單道100~1000μl、多道 30~300 μl
試      劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制
配液1  0.1M K₂HPO₄溶液：
稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。
配液2  1M HCl 溶液：
取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。
配液3  1M NaOH溶液：
稱4g NaOH加去離子水定容至100ml
配液4  樣本復溶液：
將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。
u 樣本處理
（a）肌肉、雞蛋樣本處理方法
1、 稱取1±0.05g的均質(zhì)物，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100μl衍生化試劑，充分振蕩2min；
2、 在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；
3、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復離心）；
5、 取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復離心）；
7、 取50μl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):  2倍
（b）蜂蜜樣本處理方法
1、 稱取2±0.05g的均質(zhì)物（蜂蜜），分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100μl衍生化試劑，充分振蕩2min；
2、 在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；
3、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復離心）；
5、 取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復離心）；
7、 取50μl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):  1倍
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣品50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50μl/孔，然后再加入抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250μl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A液50μl/孔，再加入底物B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定：加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.04pb為1.816；0.12ppb為1.415；0.36ppb為0.74；1.08ppb為0.313；3.24ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.08ppb～3.24ppb；樣本2的濃度范圍是0.12ppb～0.36ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝	B	×100%
	B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃妥因代謝物標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?br> 八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。